Sekundär behandling tar bort lösliga organiska material, näringsämnen som kväve och fosfor, och det mesta av de svävande partiklarna som kommer undan den primära behandlingen. Oftast används biologiska processer där mikrober metaboliserar organiska föreningar och näringsämnen för att växa och reproducera. De två vanligaste biologiska sekundära reningsprocesserna är ansluten tillväxt- och svävande tillväxtsystem. En svävande tillväxtprocess främjar tillväxten av svävande mikroorganismflockar från enskilda organismer som redan finns i avloppsvattnet och i det returaktiverade slammet. Flockarna innehåller mikroorganismer som kan ta bort föroreningar genom aeroba, anoxiska och anaeroba miljöer. När föroreningarna avlägsnats skickas flockarna till en sekundär sedimenteringsprocess där de separeras från vattnet via gravitation. En del av slammet i botten av den sekundära sedimenteringsbassängen leds sedan tillbaka uppströms för att blandas med det primära utflödet (returaktiverat slam) för att skapa blandad vätska. Resten av slammet tas bort från processen (avfallsaktiverat slam) för att skapa den perfekta ekologin av mikroorganismer. Fästa tillväxtsystem förlitar sig på mikroorganismerna för att fästa på ett medium och skapa en biofilm. Det sjunkna avloppsvattnet antingen blandas eller stänks över det biofilmbelagda materialet där mikroorganismerna tar bort föroreningar. Precis som den svävande tillväxtprocessen, skickas biofilmfragment och svävande flockar till en sekundär sedimenteringsbassäng för separering där slam återvinns och avfallsvatten och rent vatten skickas vidare till nästa process.
För att biologisk behandling ska fungera effektivt, behöver mikroorganismerna näringsämnen i ett balanserat förhållande, däribland kol, kväve och fosfor (refereras till som C:N:P) samt spårelement, däribland järn, koppar, zink, nickel, mangan, kalium, svavel och andra komponenter som normalt förekommer i avloppsvatten. Det allmänt vedertagna C:N:P-förhållandet är 100:5:1, även om vissa faciliteter frodas utanför detta förhållande, medan andra upplever polysackaridslembildning eller filamentös bakterietillväxt som hämmar biologi och sedimentering i den sekundär sedimenteringsbassängen.
Flera biologiska processer kan användas för att slutföra sekundär behandling, däribland luftningsbassänger med pluggflöde, kompletta blandluftningsbassänger, sekvensieringssatsreaktorer, oxideringsdiken, förkrympta filter, röriga biologiska reaktorer, inbyggt fast filmaktiverat slam och andra.
Biologisk borttagning av näringsämnen (BNR) förändrar miljön för mikroorganismerna för att avlägsna kväve och fosfor från vattnet. En BNR-process består av anaeroba (inget syre eller nitrat), anoxiska (inget syre, nitrat förekommer) och aerobiska (syre finns) stadier, under vilka vattnet förs genom en serie av kammare för att utföra olika biologiska funktioner.
Kemiska behandlingsprocesser kan också användas, t.ex. kemiskt avlägsnande av fosfor. Genom att introducera en kemisk fällningskemikalie inom luftningsbassängen och sedimenteringsbassängerna, avskiljs fosfor genom flockning och det binds i olösliga föreningar som sätter sig och kan tas bort som slam.